蛋白純化系統(tǒng)、超微量核酸蛋白測定儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)、雙光束核酸蛋白檢測儀、紫外分析儀、紫外檢測儀、恒流泵、自動部分收集器等為**的十幾個產(chǎn)品系列
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蛋白純化常見問題總結(jié)
日期：2024-11-25 10:37
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摘要：蛋白純化過程中常遇見些問題，這里整理了以下幾個蛋白純化實驗中遇見的問題及其解決方案。
1)我現(xiàn)在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有活性。
請問有哪些可能會出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測過基因序列，沒有問題。細胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50%～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強溶解部分，目的蛋白疏水性比較強。
既然是疏水性很強...
蛋白純化過程中常遇見些問題，這里整理了以下幾個蛋白純化實驗中遇見的問題及其解決方案。
1)我現(xiàn)在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有活性。
請問有哪些可能會出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測過基因序列，沒有問題。細胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50%～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強溶解部分，目的蛋白疏水性比較強。
既然是疏水性很強你可以加點甘油或者乙醇降低性，這樣溶解就會好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低性，同時保護你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監(jiān)測下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對溶解度有沒有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點，這也是個辦法。
2)請問有沒有合成過配體為FMN的親和膠?
親和的填料合成過20來種，你是希望用它來純化某種脫氫酶嗎，我看FMN可偶聯(lián)的有限，倒是FAD有活潑的氨基好偶聯(lián)，何況它們幾乎是同個輔酶，你是不是考慮把FAD連上去。當(dāng)然FMN的結(jié)構(gòu)上也有個仲胺，可以偶聯(lián)到帶長手臂的環(huán)氧活化的填料上，而溴化氰活化或別的活化的介質(zhì)都不大好，因此我覺得這個沒有什么問題。
此外如果是以FMN為輔酶的，那我還可以建議你試試藍色瓊脂糖凝膠，因為它的配基的結(jié)構(gòu)和FMN的三個環(huán)很相似，它能純化不少脫氫酶和激酶。
相應(yīng)的偶聯(lián)的材料，要自己合成親和填料，有很多公司都活化好的介質(zhì)，自己偶聯(lián)就可以，其中比較常用的有啟維益成公司的溴化氰瓊脂糖凝膠，環(huán)氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好，此外也曾經(jīng)有文獻報導(dǎo)固定輔酶時，偶聯(lián)位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
不同的活化的介質(zhì)對偶聯(lián)的配基有不同的要求，所以要先對自己的配基有個清楚的了解就可以選擇合適的活化介質(zhì)。
我般在合成的時候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠，它能應(yīng)用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質(zhì)剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應(yīng)基團。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定，配基脫落少。我覺得是不錯的選擇。
包涵體的蛋白復(fù)性做得不多，但是我記得有個哥們說管用的辦法也是簡單的方法，他說在復(fù)性的時候盡量別想什么太難的技術(shù)，那些時髦但不定好用，常用的有透析復(fù)性，稀釋復(fù)性，包括外的專也這么說。我覺得有時候開始摸不出來未必就是方法不行，關(guān)鍵要經(jīng)常改變條件。
層析復(fù)性很時髦，但是真正能用的不是很多，我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同，所以關(guān)鍵要多看文獻，多琢磨自己蛋白的特性，多嘗試。
3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時，鹽濃度太對柱效有影響嗎?若有，般對鹽濃度限度如何?
大別客氣，除鹽對于濃度應(yīng)該也是有定的限制的，同樣的樣品鹽濃度的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對需要的柱子的分辨率也要點，但是在正常的范圍如1-2M應(yīng)該影響不大，不過要除得很干凈還是盡量少上點樣品，我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。
4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，般用離子交換和親和層析純化，現(xiàn)在我用聚乙醇修飾它，分子量增加5000左右，修飾率不可能達到，請問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開?(當(dāng)然修飾后還殘留有聚乙醇，這個小分子也要除掉)
他們大多用凝膠過濾，我覺得這也不錯的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不樣，修飾度越那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應(yīng)該是不錯的選擇。此外PEG是個疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強，修飾度越，疏水性越強，可以用這個原理分離。離子交換也可以選擇，因為同樣道理，修飾度越，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此應(yīng)該修飾度越越先出。親和也離子交換樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開，你在這幾個方法里選擇看哪個更經(jīng)濟好用就可以。
5)我有個問題困繞很久，從**中提取酶，好像用常規(guī)的方法(超聲波破壁，緩沖液提取)，總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏水性較強，需要加助溶劑才能提取出來?另外，我是不是也可以加點甘油或者PEG來提取?
其實這個問題我覺得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標(biāo)蛋白的分子量你是應(yīng)該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問題你再解決如何提取。
對于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾經(jīng)提取個酶用水就是提取不出來，需要用鹽才能提取出來，多試試，設(shè)計個方案，這樣才能解決問題，所以不定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會不會有問題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續(xù)探討。
6)HPLC是用來分析檢測或分離純化?
如果可以用來純化，上樣量那么小有什么意義呢?
如果是用來分析檢測，怎樣指導(dǎo)以后的分離純化工作呢?
HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質(zhì)，同時配合質(zhì)譜等就可以得到很多單蛋白的特性包括序列等，這些純度的組分是用般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，所以也可以用于定量和定性，是分析中不可缺少的工具。
1)我現(xiàn)在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有活性。
請問有哪些可能會出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測過基因序列，沒有問題。細胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50%～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強溶解部分，目的蛋白疏水性比較強。
既然是疏水性很強你可以加點甘油或者乙醇降低性，這樣溶解就會好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低性，同時保護你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監(jiān)測下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對溶解度有沒有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點，這也是個辦法。
2)請問有沒有合成過配體為FMN的親和膠?
親和的填料合成過20來種，你是希望用它來純化某種脫氫酶嗎，我看FMN可偶聯(lián)的有限，倒是FAD有活潑的氨基好偶聯(lián)，何況它們幾乎是同個輔酶，你是不是考慮把FAD連上去。當(dāng)然FMN的結(jié)構(gòu)上也有個仲胺，可以偶聯(lián)到帶長手臂的環(huán)氧活化的填料上，而溴化氰活化或別的活化的介質(zhì)都不大好，因此我覺得這個沒有什么問題。
此外如果是以FMN為輔酶的，那我還可以建議你試試藍色瓊脂糖凝膠，因為它的配基的結(jié)構(gòu)和FMN的三個環(huán)很相似，它能純化不少脫氫酶和激酶。
相應(yīng)的偶聯(lián)的材料，要自己合成親和填料，有很多公司都活化好的介質(zhì)，自己偶聯(lián)就可以，其中比較常用的有啟維益成公司的溴化氰瓊脂糖凝膠，環(huán)氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好，此外也曾經(jīng)有文獻報導(dǎo)固定輔酶時，偶聯(lián)位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
不同的活化的介質(zhì)對偶聯(lián)的配基有不同的要求，所以要先對自己的配基有個清楚的了解就可以選擇合適的活化介質(zhì)。
我般在合成的時候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠，它能應(yīng)用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質(zhì)剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應(yīng)基團。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定，配基脫落少。我覺得是不錯的選擇。
包涵體的蛋白復(fù)性做得不多，但是我記得有個哥們說管用的辦法也是簡單的方法，他說在復(fù)性的時候盡量別想什么太難的技術(shù)，那些時髦但不定好用，常用的有透析復(fù)性，稀釋復(fù)性，包括外的專也這么說。我覺得有時候開始摸不出來未必就是方法不行，關(guān)鍵要經(jīng)常改變條件。
層析復(fù)性很時髦，但是真正能用的不是很多，我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同，所以關(guān)鍵要多看文獻，多琢磨自己蛋白的特性，多嘗試。
3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時，鹽濃度太對柱效有影響嗎?若有，般對鹽濃度限度如何?
大別客氣，除鹽對于濃度應(yīng)該也是有定的限制的，同樣的樣品鹽濃度的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對需要的柱子的分辨率也要點，但是在正常的范圍如1-2M應(yīng)該影響不大，不過要除得很干凈還是盡量少上點樣品，我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。
4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，般用離子交換和親和層析純化，現(xiàn)在我用聚乙醇修飾它，分子量增加5000左右，修飾率不可能達到，請問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開?(當(dāng)然修飾后還殘留有聚乙醇，這個小分子也要除掉)
他們大多用凝膠過濾，我覺得這也不錯的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不樣，修飾度越那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應(yīng)該是不錯的選擇。此外PEG是個疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強，修飾度越，疏水性越強，可以用這個原理分離。離子交換也可以選擇，因為同樣道理，修飾度越，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此應(yīng)該修飾度越越先出。親和也離子交換樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開，你在這幾個方法里選擇看哪個更經(jīng)濟好用就可以。
5)我有個問題困繞很久，從**中提取酶，好像用常規(guī)的方法(超聲波破壁，緩沖液提取)，總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏水性較強，需要加助溶劑才能提取出來?另外，我是不是也可以加點甘油或者PEG來提取?
其實這個問題我覺得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標(biāo)蛋白的分子量你是應(yīng)該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問題你再解決如何提取。
對于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾經(jīng)提取個酶用水就是提取不出來，需要用鹽才能提取出來，多試試，設(shè)計個方案，這樣才能解決問題，所以不定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會不會有問題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續(xù)探討。
6)HPLC是用來分析檢測或分離純化?
如果可以用來純化，上樣量那么小有什么意義呢?
如果是用來分析檢測，怎樣指導(dǎo)以后的分離純化工作呢?
HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質(zhì)，同時配合質(zhì)譜等就可以得到很多單蛋白的特性包括序列等，這些純度的組分是用般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，所以也可以用于定量和定性，是分析中不可缺少的工具。
分析出來后如果這個物質(zhì)很穩(wěn)定，直接線性放大就可以做大規(guī)模的制備，因此摸好了分析的條件也就相應(yīng)有了制備的條件。
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