PCR原理與應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReactionm,PCR)是項(xiàng)體外基因擴(kuò)增技術(shù),1985年美PE公司人類(lèi)遺傳研究室發(fā)明了該項(xiàng)技術(shù),Saiki等先應(yīng)用于鐮狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷,但由于操作方法繁瑣未能**推廣應(yīng)用。直到1988年耐熱DNA聚合酶(Taq酶)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,使PCR技術(shù)變得為簡(jiǎn)單,才被迅速應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物工程、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)等域,PCR技術(shù)已經(jīng)作為分子生物學(xué)發(fā)展道路上個(gè)里程碑，永載史冊(cè)。
()PCR技術(shù)的基本原理
   類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
   ① 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
   ② 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
  ③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍(Plateau)。 到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。在此同時(shí)認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的。

    50年代初Zamecnik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細(xì)胞組分實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)微粒體(microsome)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分離出tRNA并對(duì)它們?cè)诤铣傻鞍踪|(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能提出了假設(shè)；1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中mRNA與核糖體的結(jié)合；1965年Holley次測(cè)出了酵母丙氨酸t(yī)RNA的結(jié)構(gòu)；特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼，隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認(rèn)識(shí)了蛋白質(zhì)翻譯合成的基本過(guò)程。
    從分子生物學(xué)的發(fā)展過(guò)程，可以看到在近半個(gè)世紀(jì)中它是生命科學(xué)范圍發(fā)展為迅速的個(gè)前沿域，推動(dòng)著整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展。至今分子生物學(xué)仍在迅速發(fā)展中，新成果、新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但分子生物學(xué)的歷史還短，積累的資料還不夠。例如：在地球上千姿萬(wàn)態(tài)的生物攜帶龐大的生命信息，迄今人類(lèi)所了解的只是少的部分，還未認(rèn)識(shí)核酸、蛋白質(zhì)組成生命的許多基本規(guī)律；又如即使到2005年我們已經(jīng)獲得人類(lèi)基因組DNA3×109bp的全序列，確定了人的5-10萬(wàn)個(gè)基因的結(jié)構(gòu)，但是要徹底搞清楚這些基因產(chǎn)物的功能、調(diào)控、基因間的相互關(guān)系和協(xié)調(diào)，要理解80%以上不為蛋白質(zhì)編碼的序列的作用等等，都還要經(jīng)歷漫長(zhǎng)的研究道路?？梢哉f(shuō)分子生物學(xué)的發(fā)展前景光輝燦爛，道路還會(huì)艱難曲折。
    ④、特異性強(qiáng) 作為引物的寡核苷酸與模板結(jié)合的正確性是決定反應(yīng)產(chǎn)物是否特異的關(guān)鍵。
　　⑤、對(duì)原始材料質(zhì)量要求低 含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者總RNA，就可以用做反應(yīng)起始材料來(lái)獲取目的產(chǎn)物。
（）PCR技術(shù)的應(yīng)用
1、生命科學(xué)
　　a、人類(lèi)基因組計(jì)劃 隨著的PCR日臻完善，科學(xué)于2003年在完成的人類(lèi)基因組“工作框架圖”的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)整理、分類(lèi)和排列后得到的更加準(zhǔn)確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對(duì)人類(lèi)基因組基本面貌的次揭示，表明科學(xué)們開(kāi)始部分“讀”出人類(lèi)生命“天書(shū)”所蘊(yùn)涵的內(nèi)容。
　　b、后基因組計(jì)劃 人類(lèi)基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態(tài)性及其單倍型以及尋找其在生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中重要成為人們關(guān)心的熱點(diǎn)。以研究基因功能為**的“后基因組時(shí)代”已經(jīng)來(lái)臨，大規(guī)模的結(jié)構(gòu)基因組、蛋白質(zhì)組以及**基因組的研究計(jì)劃已經(jīng)成為新的熱點(diǎn)。
　　c、物種的分類(lèi)、進(jìn)化及親緣關(guān)系 可以進(jìn)行物種進(jìn)化的保守性分析及物種多態(tài)性分析、物種鑒定。
2、醫(yī)藥
　　a、**的診斷和** 遺傳性**：如地中海貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、凝血因子缺乏等有遺傳傾向的**，尤其是老年性**，如糖尿病、血脂癥、甚至腫瘤中的部分，均可預(yù)測(cè)；*基因的檢測(cè)和診斷：檢測(cè)惡性腫瘤的標(biāo)記物來(lái)診斷*癥等**；利用基因**方法**腫瘤性**。
　　b、致病病原體的檢測(cè) 檢測(cè)范圍包括**、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原蟲(chóng)及寄生蟲(chóng)、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等切微生物。檢測(cè)的靈敏度和特異性都遠(yuǎn)于當(dāng)前的**學(xué)方法，所需時(shí)間也已達(dá)到臨床要求，這對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），**（如結(jié)核、***）和原蟲(chóng)（如梅毒螺旋體）等來(lái)說(shuō)尤為適用。
　　c、DNA指紋、個(gè)體識(shí)別（DNA身份證）、親子關(guān)系鑒別和法醫(yī)物證 可以用根頭發(fā)、個(gè)細(xì)胞、個(gè)精子來(lái)完成上述工作，這域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型。
　　d、生物工程制藥 許多**可通過(guò)工程菌和細(xì)胞來(lái)大量生產(chǎn)，如干擾素、白介素、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素等**。
　　e、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥及**模型 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與醫(yī)學(xué)及生物醫(yī)藥研究的關(guān)系越來(lái)越密切。近年來(lái),各種人類(lèi)**轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型不斷建立。如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在遺傳病、心血管**、腫瘤、血壓病、病毒性**、異種移植、輸血醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)研究中的應(yīng)用；利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物-乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)**蛋白,好比在動(dòng)物身上建“藥廠”,可以從動(dòng)物乳汁中源源不斷地獲得具有穩(wěn)定生物活性的基因產(chǎn)品。這是種全新的**生產(chǎn)模式,具有投資成本低,**研制周期短和經(jīng)濟(jì)效益等點(diǎn)。 　　　　　　　　　　　　    f、中藥材真?zhèn)舞b別　利用DNA分子的特征進(jìn)行物種鑒別的DNA分子標(biāo)記鑒別法,與現(xiàn)有的中藥鑒別方法相比具有以下主要特點(diǎn):1)準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性好,真實(shí)、穩(wěn)定、可靠;2)不受樣品形態(tài)的限制,原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中成藥(丸劑、散劑等)均可應(yīng)用;3)所需檢樣量少,對(duì)**藥材及化石標(biāo)本的鑒定更具應(yīng)用價(jià)值;4)PCR技術(shù)的快速、便捷性使得DNA分子標(biāo)記鑒別法更適宜推廣使用。
3、農(nóng)業(yè)科學(xué)
    a、轉(zhuǎn)基因植物 按其功能主要分提產(chǎn)量、抗病力、抗除草劑、改良品質(zhì)和發(fā)育調(diào)節(jié)。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。
    b、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 在農(nóng)業(yè)方面，主要在改良畜禽生產(chǎn)性狀,提畜禽抗病力及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜產(chǎn)品。
4、環(huán)境科學(xué)
    a、環(huán)境生態(tài)研究 PCR-FLP技術(shù)為環(huán)境地球化學(xué)了種新的研究方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的新的思維方式。此方法具有所需樣品量低、快速簡(jiǎn)便及特征性強(qiáng)等點(diǎn),可廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)、環(huán)境過(guò)程的生物作用、生物多樣性及有機(jī)物源判斷等方面的研究。展望未來(lái)研究成果,將會(huì)在海洋及湖泊沉積物等自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)更多的、新的微生物種類(lèi)；將進(jìn)步闡明生物作用和物質(zhì)循環(huán)的機(jī)理和過(guò)程；進(jìn)步闡明自然環(huán)境中生物大分子的變化機(jī)理及其環(huán)境效應(yīng)并找到判斷沉積物有機(jī)物。
    b、環(huán)境監(jiān)測(cè) 長(zhǎng)期以來(lái)檢測(cè)外環(huán)境（水樣中的霍亂弧菌、空氣中產(chǎn)氣莢膜桿菌、海洋中已知病菌及有害生物如藻類(lèi)等）均用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法,既繁瑣耗時(shí),檢出率又低，而用PCR方法能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)外環(huán)境致病性**盒有害生物。
5、考古學(xué)及歷史事件解讀
    利用人類(lèi)短串聯(lián)重復(fù)STR-PCR技術(shù)，研究人類(lèi)種族的遺傳多態(tài)性，效果非常穩(wěn)定。目前此技術(shù)已廣泛用于生物考古、種系發(fā)育、民族學(xué)、人類(lèi)學(xué)和考古學(xué)等各個(gè)域中。
 

6、衛(wèi)生**
    a、食品微生物的檢測(cè) 傳統(tǒng)的致病菌檢測(cè)先經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，應(yīng)用PCR技術(shù)則非常迅速、準(zhǔn)確。主要用于：食品致病菌的檢測(cè)，如肉毒唆菌等；乳酸菌的檢測(cè)；水中**指標(biāo)測(cè)定。

    b、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè) 目前轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)有100多物種，大多數(shù)已經(jīng)用于食品。轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人體健康的危害及對(duì)生態(tài)的影響也日受廣泛的重視，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)成為控制其泛濫的種手段。
    c、動(dòng)、植物檢疫　靈敏、特異、快速診斷檢測(cè)方法是我進(jìn)出口口岸的門(mén)衛(wèi)，檢查出入門(mén)的人員、動(dòng)、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染?。ò?、動(dòng)物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門(mén)氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于門(mén)之外，是提我綜合力的必要保證。