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PCR新手指南系列：PCR產(chǎn)物電泳條帶分析
日期：2024-11-26 05:29
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摘要：PCR擴增后般進行瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳后般有以下幾種條帶：
1、引物帶。引物濃度過或是擴增效率不是特別時都會有，般不呈現(xiàn)為細帶，為發(fā)散狀；如果目的擴增產(chǎn)物帶和引物帶都很亮，可以考慮適當(dāng)降低引物量。
2、引物聚體帶。比引物跑得慢點，條帶清晰，但如果擴增產(chǎn)物小于100bp時，產(chǎn)物與引物聚體就不好分別了，建議采用DNA聚丙烯酰胺電泳（不是蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺電泳）；如果引物聚體在化復(fù)性溫度后仍然嚴重影響目的產(chǎn)物的擴增，先考慮更換引物設(shè)計（因為引物合成的成本比反復(fù)化條件的成本低）
3、...
PCR擴增后般進行瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳后般有以下幾種條帶：
1、引物帶。引物濃度過或是擴增效率不是特別時都會有，般不呈現(xiàn)為細帶，為發(fā)散狀；如果目的擴增產(chǎn)物帶和引物帶都很亮，可以考慮適當(dāng)降低引物量。
2、引物聚體帶。比引物跑得慢點，條帶清晰，但如果擴增產(chǎn)物小于100bp時，產(chǎn)物與引物聚體就不好分別了，建議采用DNA聚丙烯酰胺電泳（不是蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺電泳）；如果引物聚體在化復(fù)性溫度后仍然嚴重影響目的產(chǎn)物的擴增，先考慮更換引物設(shè)計（因為引物合成的成本比反復(fù)化條件的成本低）
3、目的擴增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計大小相同，條帶清晰。
4、非特異擴增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計大小不相同，條帶清晰。般考慮通過提復(fù)性溫度來減少或消除（也可用溫度梯度功能來尋找的復(fù)性溫度，東勝龍811型PCR儀就有此功能）。如果其片段大小比目的片段大較多，可以通過減少延伸時間來減少或消除（即不給它足夠的延伸時間）。還有種非特異擴增產(chǎn)物帶是來自于逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗時的基因組DNA的污染，如果目的擴增產(chǎn)物中有內(nèi)含子，擴增產(chǎn)物很可能大于目的基因。這種條帶通過化復(fù)性溫度是不能消除的，可以在逆轉(zhuǎn)錄前用無RNA酶的DNA酶進行樣本處理。
1、引物帶。引物濃度過或是擴增效率不是特別時都會有，般不呈現(xiàn)為細帶，為發(fā)散狀；如果目的擴增產(chǎn)物帶和引物帶都很亮，可以考慮適當(dāng)降低引物量。
2、引物聚體帶。比引物跑得慢點，條帶清晰，但如果擴增產(chǎn)物小于100bp時，產(chǎn)物與引物聚體就不好分別了，建議采用DNA聚丙烯酰胺電泳（不是蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺電泳）；如果引物聚體在化復(fù)性溫度后仍然嚴重影響目的產(chǎn)物的擴增，先考慮更換引物設(shè)計（因為引物合成的成本比反復(fù)化條件的成本低）
3、目的擴增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計大小相同，條帶清晰。
4、非特異擴增產(chǎn)物帶。其大小與設(shè)計大小不相同，條帶清晰。般考慮通過提復(fù)性溫度來減少或消除（也可用溫度梯度功能來尋找的復(fù)性溫度，東勝龍811型PCR儀就有此功能）。如果其片段大小比目的片段大較多，可以通過減少延伸時間來減少或消除（即不給它足夠的延伸時間）。還有種非特異擴增產(chǎn)物帶是來自于逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗時的基因組DNA的污染，如果目的擴增產(chǎn)物中有內(nèi)含子，擴增產(chǎn)物很可能大于目的基因。這種條帶通過化復(fù)性溫度是不能消除的，可以在逆轉(zhuǎn)錄前用無RNA酶的DNA酶進行樣本處理。
5、模板DNA帶。模板濃度過時可能出現(xiàn)。如果是基因組DNA為模板，條帶可能會很亂且較大。般進行PCR擴增時，模板濃度都不要太大，否則會產(chǎn)生些比目的基因長點的雜質(zhì)DNA（可能不成條帶，也看不到），這是由PCR擴增原理造成的。
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