聚合酶鏈式反應(PCR)技術概述

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術是基因擴增技術的次重大革新，是分子生物學發(fā)展史中的個重要里程碑。使用PCR擴增技術，可以將微量的靶DNA片段特異地擴增上百萬倍，大大提了對DNA分子的分析和檢測能力。PCR技術具有敏感度、特異性強、快速簡便等點，在醫(yī)學、遺傳學、法醫(yī)學、微生物學、食品檢驗、衛(wèi)生檢驗等眾多域中具有巨大的應用價值和廣闊的發(fā)展前景。

耐熱DNA聚合酶的應用是PCR技術的**。根據(jù)是否具有3’→5’端外切酶活性，耐熱DNA聚合酶通常分為無校讀活性和有校讀活性兩類。無校讀活性的DNA聚合酶（以Taq 酶為代表）具有較的擴增效率，但由于缺乏校讀活性，容易發(fā)生堿基錯配，故產物中點突變較多。Taq DNA聚合酶還具有末端轉移酶活性，可在PCR產物的3’末端非特異地添加堿基，因單個A突出堿基的比例，故PCR產物可直接與含有3’末端突出T堿基的載體連接（即TA克?。?，方便PCR產物的克隆、擴增和測序。然而，TaqDNA聚合酶在PCR反應第步升溫過程中即可催化錯配引物延伸或引物聚體形成，因而導致非特異性擴增，影響目的片段的合成量。針對這現(xiàn)象設計的熱啟動Taq DNA聚合酶，在低溫時其聚合酶活性被抑制，通過溫變性，聚合酶的活性恢復，催化特異性結合的引物擴增，因而提了目的片段的特異性和產量。另類有校讀活性的DNA聚合酶（以Pfu為代表）可選擇性地去除錯誤摻入的dNTP，維持DNA鏈的正確延伸；然而其擴增效率通常低于Taq DNA聚合酶，特別是對于長片段DNA鏈的延伸能力較差?；谏鲜鰞深惷傅奶攸c，可將適量的Taq DNA聚合酶與任意種有校讀活性的DNA聚合酶混合，在適當?shù)姆磻彌_液體系中，可獲得保真性與擴增性能介于上述兩類酶之間的混合酶，用于長片段以及復雜模板的保真擴增。
 

PCR實驗受諸多因素的影響。的商業(yè)化耐熱DNA聚合酶及其配套緩沖液通?？梢詽M足大多數(shù)DNA片段擴增的需要。先應根據(jù)模板的性質（基因組、cDNA、質粒等）和目的片段的大小、GC含量、有無結構等，選擇合適的DNA聚合酶（參見GenStar® PCR產品選擇指南）。對于難于擴增的片段，應針對不同的模板、引物，化反應條件，以獲得的擴增效率。
 

A. 模板用量：以50 μl反應體系為例
? 人基因組DNA：0.1~1.0 μg
? 大腸桿菌基因組DNA：10~100 ng
? λ DNA：0.5~5 ng
? 質粒DNA：0.1~10 ng
 

B. 引物設計原則：
? 引物長度要滿足特異性需要，般可在18~25個堿基之間；擴增長片段時好在24~30個堿基之間；
? （G+C）%含量應盡量控制在40~60%，兩條引物的（G+C）%含量應盡量接近；
? 盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上，3’端應避免使用A或T；
? 避免引物內部自身配對形成結構；
? 正反向引物之間應避免配對堿基，尤其是3’端的三個堿基，否則易生成引物聚體（Primer dimer）；
? 兩條引物的Tm值應盡量接近，好相差不超過5oC；
? 引物Tm值的計算方法：
20 nt以下：Tm = 2x（A + T）+ 4x（G+C）
20 nt以上：Tm = 81.5+0.41x（G+C%）-600/nt（nt：引物的堿基數(shù)）
 

C. 引物用量：
? 0.1~1.0 μM，通?？梢?/span>0.2 μM起始，根據(jù)體系不同調整用量；
? 使用簡并引物、隨機引物時，需增加引物總量以彌補產量損失；但隨著引物量加大，特異性將降低；
? 模板較大較多，或結構較復雜（如人基因組DNA）時，需減少引物用量以提特異性；
? 模板較小較少（如質粒模板）時，增加引物用量可提產量。

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