基因組DNA提取純化的注意事項(xiàng)

大多數(shù)動物組織可以用裂解緩沖液和蛋白酶/蛋白酶 K 進(jìn)行效裂解。在加入裂解液之前需要將組織切成小塊，有條件的話建議使用 TissueLyser 或研缽等提前進(jìn)行均質(zhì)化。骨骼肌，心臟，皮膚等組織含有收縮蛋白，結(jié)締組織和膠原蛋白，所以利用蛋白酶 / 蛋白酶 K 進(jìn)行充分消化是必須的。

FFPE 樣本進(jìn)行 DNA 純化時需要預(yù)裂解。福爾馬林可由 PBS 洗滌除去，石蠟可由甲苯和乙醇進(jìn)行去除。在蛋白酶消化后提孵育的溫度有助于逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，以便更好的從 FFPE 組織中釋放 DNA，從而有助于提 DNA 產(chǎn)量和改善下游檢測性能。 從 FFPE 中得到的 DNA 通常比從新鮮或凍存樣本中得到的 DNA 分子量??；DNA 降解的程度則取決于樣本類型，儲存時間和固定的條件。

微量樣本中 DNA 的含量很低，通常小于 5 ng DNA, 通常需要使用 carrier RNA 來提產(chǎn)量（不會影響下游分析檢測）。如果需要使用 carrier RNA，那么在測量 OD 的時候會因?yàn)槭褂?carrier RNA 造成濃度測量有偏差（因?yàn)?RNA 在 260 nm 也有吸收）。

推薦使用 QIAamp DNA Micro Kit 從微量樣本中進(jìn)行 DNA 純化，該試劑盒采用 MinElute 硅膠膜柱，洗脫體積可以低至 20 μl，同時通過兩步洗滌去除 PCR 抑制劑等污染物，大程度從微量樣本中純化 DNA。

血液樣本可以是新鮮或凍存全血或干血片，由于血液樣本在采集后會迅速凝固，所以通常在采血時使用 EDTA，檸檬酸鹽或肝素進(jìn)行抗凝。經(jīng)過抗凝處理的血液樣本可以直接用于 DNA 純化，需要注意的是使用的 DNA 純化方法需要能夠去除上述抗凝劑，以免干擾下游 PCR 檢測。全血也可以在 DNA 純化前先進(jìn)行白細(xì)胞富集等再進(jìn)行 DNA 純化。

從血液中純化 DNA 的產(chǎn)量很大程度上取決于血液中的白細(xì)胞數(shù)量，而白細(xì)胞數(shù)量則和血液的供體情況有很大關(guān)聯(lián)（如貧血或感染都會造成白細(xì)胞數(shù)量變化）。上述情況必須在進(jìn)行 DNA 純化前就應(yīng)該考慮到。此外，有些動物有有核血，這意味著這類樣本中含有更多的 DNA，在從此類血樣中純化 DNA，上樣量需要減少 10 倍左右。

1. 哺乳動物細(xì)胞可以使用蛋白酶 K 進(jìn)行裂解
2. 酵母細(xì)胞需要先使用溶菌酶對細(xì)胞壁進(jìn)行處理，然后使用蛋白酶或蛋白酶 K 進(jìn)行消化
3. 許多**細(xì)胞可以使用裂解 buffer 和蛋白酶 / 蛋白酶 K 進(jìn)行裂解，某些**如革蘭氏陽性菌需要預(yù)先使用溶菌酶對細(xì)胞壁進(jìn)行處理
4. **細(xì)胞需要先從生物體液中沉淀，然后從中純化** DNA，拭子樣本需要先使用**劑進(jìn)行預(yù)處理然后再離心
5. 使用機(jī)械裂解會比用酶消化的效果要好，尤其是針對革蘭氏陽性菌或**而言