醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)原理
帶電荷的蛋白質(zhì)，在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷電性相反的電泳動(dòng)稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質(zhì)均帶負(fù)電，在電場(chǎng)中都向陽移動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)在同pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少及分子大小不同，所以在電場(chǎng)中向陽泳動(dòng)速度也不同。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷多者，泳動(dòng)速度快;反之，則泳動(dòng)速度慢。因此可將血清蛋白質(zhì)依次分為清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五條區(qū)帶，經(jīng)染色可計(jì)算出各血清蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)。
以醋酸纖維薄膜(CAM)為支持介質(zhì)，電泳分離后經(jīng)染色處理，可展示出清晰的蛋白質(zhì)電泳圖譜。由于染色時(shí)染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合與蛋白質(zhì)的量成正比，因此將各蛋白質(zhì)帶剪下，分別用定量的NaOH稀溶液洗脫下來，即可進(jìn)行比色，測(cè)定出各蛋白質(zhì)區(qū)帶的相對(duì)含量。也可用定量的有機(jī)溶劑使CAM溶解制成透明膜而用光密度計(jì)進(jìn)行掃描定量。
醋酸纖維薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便及分辨率較等點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)試劑
1.***—***鈉緩沖液(pH8.6，m=0.06)。稱取***2.21克和***鈉12.36克，溶于500毫升蒸餾水中，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水稀釋至1000毫升。
2.染色液
(1)麗春紅S染色液：稱取麗春紅S O.4g、三氯醋酸6g，用蒸溜水溶解并稀釋至100ml。
(2)氨基黑10B染色液：稱取氨基黑(C22H13O12N6S3Na3)10B 0.1g,溶于20ml無水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水楊酸2.5g，溶于少量的蒸餾水中，加入前液將兩液混合搖勻，再以蒸餾水補(bǔ)足至100ml。稱取麗春紅S0.4克及三氯醋酸6克;用蒸餾水溶解，并稀釋至100毫升。
3.漂洗液。
(1)3%(V/V)醋酸溶液：適用于麗春紅S染色的漂洗。
(2)甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸餾水50ml混勻，適用于氨基黑10B染色的漂洗。
4.透明液 取無水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混勻備用。
5. 洗脫液
(1)0.1mol/L NaOH溶液：用于麗春紅S染色的洗脫。
(2)0.4mol/L NaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脫。
6.40%(V/V)醋酸溶液。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備 電泳儀、電泳槽、分光光度計(jì)或光密度儀。
實(shí)驗(yàn)材料 醋酸纖維薄膜、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、點(diǎn)樣器、直尺、鉛筆、剪刀等。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、電泳槽的準(zhǔn)備
將***-***鈉緩沖液加入電泳槽中(兩側(cè)槽內(nèi)注入等量的緩沖液)，調(diào)節(jié)兩側(cè)內(nèi)的緩沖液，使其在同水平面，液面與支架的距離約為2～2.5cm。支架寬度到恰好適合CAM的長(zhǎng)度，用3～4層濾紙或4層紗布搭橋。
2、CAM準(zhǔn)備
取醋纖薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的無光澤面(涂有醋酸纖維素)距端1.5cm處用直尺和鉛筆輕劃線(與CAM的長(zhǎng)軸垂直)，作點(diǎn)樣標(biāo)記，將膜條編號(hào)后將無光澤面朝下浸入***-***鈉緩沖液中，待充分浸透后取出(般約需求20～30min)，夾于潔凈的濾紙中,吸去多余的緩沖液.
3、點(diǎn)樣
用血清加樣器將3-5ul無溶血的新鮮血清均勻地點(diǎn)在劃線處，樣品應(yīng)與膜的邊緣保持定距離，以免電泳圖譜中的蛋白區(qū)帶變形。待血清滲入膜后移開點(diǎn)樣器。點(diǎn)樣應(yīng)注意，要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。
4、平衡
將已點(diǎn)樣的薄膜加樣面朝下，點(diǎn)樣端置于陰端，將膜條緊貼于電泳槽支架的鹽橋上并保持平直，橋的另端垂入緩沖液中，鹽橋?qū)⒛さ膬啥伺c緩沖液連通，加上槽蓋平衡5min后通電電泳。
5、電泳
正確聯(lián)接電泳槽與整流器對(duì)應(yīng)的正負(fù)，點(diǎn)樣側(cè)接負(fù)，另側(cè)接正。開啟電源通電。調(diào)節(jié)電壓10V～15V/cm膜長(zhǎng),電流0.4～0.6mA/cm膜總寬，電泳40-60分鐘(通常夏季需45min,冬季需60min)，待電泳區(qū)帶展開3.5cm～4cm時(shí)即可關(guān)閉電源。
6、染色
通電完畢，立即取出薄膜直接浸入麗春紅S或氨基黑10B染色液中，染色5～10分鐘。
7、漂洗
至少準(zhǔn)備3～4個(gè)漂洗皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜條并盡量瀝去染色液，按順序投入漂洗液中反復(fù)漂洗，直至背景漂白為止。此時(shí)清晰可見5條色帶。待干。
8、定量
(1)洗脫比色法 取六支試管，分別標(biāo)明“A、α1、α2、β、γ、空白”。將漂洗凈的薄膜剪下各區(qū)帶放入相應(yīng)的試管內(nèi)，另從空白背景剪塊平均大小的膜條置于空白管中，根據(jù)染色不同按以下方法洗脫。
①氨基黑10B染色洗脫：6支試管于清蛋白管內(nèi)加入0.4mmol/L NaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振搖數(shù)次，置37℃水浴20分鐘，使色澤完全浸出。用620nm波長(zhǎng)，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。
②麗春紅S染色洗脫：洗脫液用0.1mmol/L氫氧化鈉溶液，加入量同上。10分鐘后，于清蛋白管內(nèi)加入40%(V/V)醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氫氧化鈉，使溶液色澤加深。如出現(xiàn)沉淀，可離心取上清液比色。用520nm波長(zhǎng)，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。
(2)光密度掃描法
① 透明：將已漂凈吹干的CAM條浸入透明液中3～5分鐘，取出平鋪于潔凈干燥玻片上(應(yīng)無氣泡)，直立片刻除去過多的透明液。于90～100℃烘箱內(nèi)烘烤5～10分鐘，取出冷卻至室溫。此法透明的CAM，各蛋白區(qū)帶鮮明，薄膜平整，可直接掃描或作保存。若用十萘氫或液體石醋透明，應(yīng)將漂洗過的薄膜烘干后進(jìn)行透明，透吸后的薄膜不能久藏，易發(fā)生皺折。
② 掃描定量：將已透明的薄膜放入全自動(dòng)光密度計(jì)或其它光密度掃描的光路，選擇波長(zhǎng)520nm，描記各蛋白區(qū)帶峰，并計(jì)算各蛋白成分的相對(duì)含量。
9、計(jì)算
定量計(jì)算時(shí)，先計(jì)算各光密度值的總和：再計(jì)算血清各部分蛋白質(zhì)所占的百分率
吸光度總和(T)=2A+α1+α2+β+γ(吸光度)
血清各蛋白組分的相對(duì)百分?jǐn)?shù)=Ax/AT×
Ax表示各球蛋白組分 (2A+α1+α2+β+γ)的吸光度。
A%=2A/ T× β=β/ T×
α1%=α1/ T× γ%=γ/ T× α2%=α2/ T×
各組分蛋白質(zhì)含量(g/L)=(各組分蛋白百分?jǐn)?shù)(%)×血清總蛋白g/L)/100
10、臨床意義
(1)血清蛋白醋纖薄膜電泳的正常參考值為：
蛋白質(zhì)組分 g/L 占總蛋白百分比(%)
白蛋白 35～52 57.0～68.0
α1球蛋白 1.0～4.0 1.0～5.7
α2球蛋白 4.0～8.0 4.9～11.2
β球蛋白 5.0～10.0 7.0～13.0
γ球蛋白 6.0～13.0 9.8～18.2
(2)臨床意義
電泳圖譜可為臨床**診斷依據(jù)。
腎病型可見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，α2和β升;肝硬化型可見于慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬變等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，β和γ增，可出現(xiàn)β與γ難以分離而連接在起的“β-γ”橋，此現(xiàn)象是由于肝臟纖維增生導(dǎo)致IgA增所致;急性反應(yīng)時(shí)相型常以α1、α2增為特征;慢性炎癥型則以Alb降低，α2、γ增較為常見;M蛋白血癥主要見于多發(fā)性骨髓瘤，病人有大量單克隆蛋白質(zhì)(主要是IgG或IgA)，電泳時(shí)可在β和βγ之間出現(xiàn)條峰形狹窄的區(qū)帶，稱M區(qū)帶。
注意事項(xiàng)
1.通電時(shí)，不得接觸槽內(nèi)的緩沖液或CAM，以防觸電。
2.每次電泳時(shí)應(yīng)交換電以使兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖液的正負(fù)離子相互交換，以使緩沖液的PH維持在定水平。
3.電泳緩沖液的液面要保持定的度，過低可能會(huì)出現(xiàn)γ球蛋白的電滲現(xiàn)象(γ球蛋白向陰移動(dòng))，同時(shí)電泳槽兩側(cè)的液面應(yīng)保持在同水平，否則，通過薄膜時(shí)有虹吸現(xiàn)象，將會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)速度。
4.電泳失敗或圖譜不理想的常見原因
(1)電泳圖譜不整齊或蛋白各組分分：點(diǎn)樣過多;點(diǎn)樣不均勻、不整齊;薄膜過濕，樣品擴(kuò)散;點(diǎn)樣速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或溫度過致使膜面局部干燥或水分蒸發(fā);緩沖液變質(zhì);電泳時(shí)薄膜放置不正，歪斜、彎曲，與電流方向不平行;樣品不新鮮;電流過低;CAM質(zhì)量不好，薄膜結(jié)構(gòu)過分細(xì)密，透水性差，導(dǎo)電差等。
(2)染色后白蛋白中間著色淺：染色時(shí)間不夠或染色液陳舊;白蛋白含量過，可減少血清用量或延長(zhǎng)染色時(shí)間。
(3)電泳速度慢：電流過低;供給薄膜的緩沖液不足，連接薄膜與緩沖液的濾紙或紗布過薄;溫度過低;薄膜結(jié)構(gòu)過分細(xì)密，透水性差，導(dǎo)電差;緩沖液水分蒸發(fā)，致使離子強(qiáng)度增大。
(4)薄膜透明不完全：透明液陳舊;浸泡時(shí)間不足;烘箱溫度未到90℃即把薄膜放入。
5.染料問題：各種染料對(duì)血清各組分有不同的親和力，大多數(shù)染料對(duì)白蛋白的親和力大于球蛋白。如氨基黑10B對(duì)球蛋白的結(jié)合力為白蛋白的80%，因此常導(dǎo)致白蛋白結(jié)果偏，球蛋白偏低。用麗春紅S染色，效果于氨基黑10B。麗紅是種指示劑，PH<10時(shí)呈紅色，PH>12.5時(shí)呈紫色。在酸性溶液中它的大吸收峰在523nm左右，呈對(duì)稱性。在血清蛋白正常濃度范圍內(nèi)，麗春紅S能與各蛋白質(zhì)組分成正比例結(jié)合，而氨基黑10B則對(duì)白蛋白染色過深，區(qū)帶中容易出現(xiàn)著色不全的小點(diǎn)，不夠理想。
6.樣品要求點(diǎn)在粗糙面(無光澤面)，否則樣品很難吸入膜內(nèi)。電泳時(shí)好將點(diǎn)有樣品的面朝下，以防電泳過程中水分蒸發(fā)，影響電泳結(jié)果。
7.標(biāo)本應(yīng)新鮮，不得溶血。溶血標(biāo)本會(huì)使β球蛋白假性升，因血紅蛋白電泳位置在β球蛋白區(qū)域內(nèi)。