為什么要從化學發(fā)光轉換到熒光檢測

日期：2024-11-25 05:23

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摘要：Western blot成像方法取決于二抗的標記物，常用的方法有基于酶促反應的化學發(fā)光法，基于熒光染料的可見熒光方法和紅外熒光方法，那么我們應該如何選擇呢？ *合適的Western blot實驗方法取決于您期望獲得哪些信息，也就是取決于您的實驗目的，小編比較了現(xiàn)有方法的優(yōu)缺點，并分享了自己的心得，希望能夠幫助您選擇到*佳的實驗方法。

Western blot成像方法取決于二抗的標記物，常用的方法有基于酶促反應的化學發(fā)光法，基于熒光染料的可見熒光方法和紅外熒光方法，那么我們應該如何選擇呢？
*合適的Western blot實驗方法取決于您期望獲得哪些信息，也就是取決于您的實驗目的，小編比較了現(xiàn)有方法的優(yōu)缺點，并分享了自己的心得，希望能夠幫助您選擇到*佳的實驗方法。

化學發(fā)光方法
化學發(fā)光western blot是相對容易且靈敏度極高的檢測方法，靈敏度可以達到fg級。
適用于研究：通過電泳可輕松分離的分子量差異顯著的蛋白。

> 檢測單一蛋白
> 確定蛋白有無
> 檢測抗體反應
> 蛋白純度分析
> 檢測低豐度蛋白

優(yōu)勢	劣勢
靈敏度高	半定量
實驗流程熟悉	酶促反應
兼容膠片和數(shù)字成像系統(tǒng)	一次只能檢測單一信號
	需要玻璃和重孵育
	膠片沒有過飽和提醒

熒光檢測方法
熒光染料分為可見熒光染料和紅外熒光染料，從而將熒光western blot檢測分為可見熒光檢測和紅外熒光檢測。目前可見熒光檢測*多三個通道，可以同時檢測三種不同的蛋白，近紅外檢測*多為兩個通道，一定選擇激光光源激發(fā)的哦，更接近近紅外染料的*大發(fā)射波長680nm和800nm，增強二抗信號，提高檢測的靈敏度。
熒光Western blot使用熒光染料標記的二抗進行檢測，膜上的靶標蛋白濃度與可見熒光信號強度呈線性關系，實現(xiàn)真實可靠的定量分析。熒光染料發(fā)射光譜不同，因此在一張印跡膜上可實現(xiàn)多重檢測。在無需剝離和重孵育條件下，進行上樣量質控，可以分析翻譯后修飾蛋白。
因此當您進行如下實驗室，選擇熒光檢測方法，妥妥的：

> 同時檢測多種蛋白
> 研究翻譯后修飾蛋白
> 同一印跡膜的上樣質控
> **定量western blot實驗

優(yōu)勢	劣勢
可進行多重檢測	膜會有自發(fā)熒光
定量
信號持久穩(wěn)定
實驗方法不需改變太多

期刊雜志要求：
例如nature中“Image Integrity and Standards”中鼓勵在一張印跡膜上進行內參和目的蛋白的的檢測，同時使用合理的標準化方法：例如：全蛋白歸一化。

化學發(fā)光屬于酶促反應，動態(tài)范圍窄，只能實現(xiàn)定性分析，一次只能檢測一個信號，如要檢測多個信號，需要剝離和重孵育，如使用膠片成像，還需要反復摸索曝光時間，顯影定影設備和設備的維護，熒光檢測可同時滿足期刊雜志發(fā)表要求、一次可進行多個信號檢測，反應條件一致，jingzhun定量，特別近紅外熒光檢測方法，具有低背景，高信噪比，是現(xiàn)在western blot熒光定量的金標準。

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