蛋白純化系統(tǒng)、超微量核酸蛋白測定儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)、雙光束核酸蛋白檢測儀、紫外分析儀、紫外檢測儀、恒流泵、自動部分收集器等為**的十幾個產(chǎn)品系列
新聞詳情
基因脈沖導(dǎo)入技術(shù)及應(yīng)用
日期：2024-10-22 23:04
瀏覽次數(shù)：3784
摘要：
生命科學(xué)儀器2005第3卷/第5期
孫云1,2，蘇明皓2，袁其平1，童崢嶸2，徐寶強2
（1.中民航學(xué)院,天津300300；2.天津理工大學(xué)光電信息與電子工程系,天津300191）
摘要 本文先介紹了細(xì)胞電穿孔的基本原理和天津理工大學(xué)自行研制的 基因脈沖導(dǎo)入儀，重點介紹了細(xì)胞電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、**、酵母上的應(yīng)用及電穿孔技術(shù)的些特殊應(yīng)用?；蛎}沖導(dǎo)入技術(shù)應(yīng)用前景十分廣泛。
關(guān)鍵詞基因脈沖導(dǎo)入，細(xì)胞電穿孔，膜電位
1細(xì)胞電穿孔的基本原理
細(xì)胞電穿孔是種新型生物物理新技術(shù)，它可使細(xì)胞可逆穿孔，從而導(dǎo)入外源RNA、DNA蛋白分子和各種小分子，產(chǎn)生具有新的生物性狀的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。該技術(shù)具有效率、低毒性、普適性和可控性的特點，在細(xì)胞工程和基因工程等方面具有廣泛應(yīng)用。
設(shè)細(xì)胞為球形，懸浮在溶液里并處于電場中。電場誘導(dǎo)的膜電位可由下式表示：
V=1.5αEcosθ
（1）式中α是細(xì)胞的半徑，E是外加電場強度，θ是經(jīng)過細(xì)胞膜任意點的徑向與電場方向之間的夾角。對于細(xì)胞的兩個點θ=0°或θ=180°，外加電場誘導(dǎo)的膜電位可進步簡化為：Vdp=1.5αE （2）
隨著外加電場強度的增大，在細(xì)胞膜上誘導(dǎo)的膜電位也隨之增大。當(dāng)增大到定程度，細(xì)胞膜將出現(xiàn)電穿孔現(xiàn)象。此時的誘導(dǎo)膜電位Vcr叫臨界膜電位，Ecr叫做臨界外加電場。般認(rèn)為，外加場強為1～10KV/cm、電脈沖的持續(xù)時間在1μs～10ms時細(xì)胞膜會出現(xiàn)微孔。
公式（1）是細(xì)胞電穿孔的理論基礎(chǔ)，又是實際應(yīng)用的依據(jù)。但是實際情況是非常復(fù)雜的。例如，所有細(xì)胞都不是理想的球形，不同細(xì)胞形態(tài)各異、大小不同，就是同種細(xì)胞的大小、形狀也有區(qū)別；不同細(xì)胞膜組分有所不同，不同的培養(yǎng)條件以及細(xì)胞懸浮液成分不同造成生理條件不同等，對電穿孔都有不同程度的影響。因此公式不能給出準(zhǔn)確值，只能給出參考值，應(yīng)用中的實際電場強度仍需由實驗來確定。
2導(dǎo)入技術(shù)
2.1導(dǎo)入技術(shù)的介紹
基因脈沖導(dǎo)入儀的主要功能是產(chǎn)生個電壓、大電流指數(shù)規(guī)律的尖脈沖。其主要組成包括壓脈沖產(chǎn)生器、微機控制板和電小池。
無論在阻或低阻（例如含鹽或蔗糖緩沖液）情況下都可以正常工作，可用于植物、動物和各種微生物的各類細(xì)胞電穿孔，并能得到很的轉(zhuǎn)化率。該儀器用電擊法和傳統(tǒng)法相比簡單易行，省時間，效率，達到外同類產(chǎn)品的致效果。
根據(jù)客戶要求在原有產(chǎn)品基礎(chǔ)上我們又做了改進，研制出LN-201、301系列產(chǎn)品。LN-301系統(tǒng)框圖如圖2所示。該儀器采用點陣式LCD顯示，能夠同時顯示多個信息，可做到漢字、字符同屏，便于用戶的操作和使用。系統(tǒng)可單脈沖和多脈沖兩種功能，便于用戶的選擇使用。組合電容由0.5、1、2、4、8、10μF的6個電容組合而成，可根據(jù)用戶的需要自由地組合。為了避免壓放電對單片機的干擾，采用了數(shù)字地和模擬地各自獨立的方式，使該儀器的穩(wěn)定性、可靠性得到較大的提。
與此配套的放電小池有1mm、2mm、4mm三種不同規(guī)格的放電小池。其中2mm、4mm小池的電有粘貼型的，1mm、2mm小池電有采用工字鋁注塑型的。
2.2電改進
在原有各種電解小池的基礎(chǔ)上，為了更好的滿足客戶在基因**和臨床醫(yī)學(xué)方面的要求，我們又提出針狀電代替放電小池的方案，研制出各種放電電如用于動物原地**注入（**增敏）和轉(zhuǎn)基因的針狀電（平行和梅花形）。四川大學(xué)實驗表明，當(dāng)定強度的瞬態(tài)電磁脈沖作用于細(xì)胞體時，在細(xì)胞膜上將形成瞬時微孔，促進**等大分子進入細(xì)胞液。利用電穿孔結(jié)合******在昆明小鼠上接種和生長的S-180肉瘤，結(jié)果證明，這種方法可以明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的生長。中醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形醫(yī)院，用針狀和平板的組合電，實驗進展很順利，取得了很好的效果。
3技術(shù)應(yīng)用
3.1電穿孔誘導(dǎo)基因的應(yīng)用
（1）電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在動物細(xì)胞上的應(yīng)用利用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞雜種已成為許多實驗室種有效的常規(guī)手段。電穿孔轉(zhuǎn)化率比傳統(tǒng)方法要數(shù)倍至上千倍。對貼壁生長的細(xì)胞，可以在單層培養(yǎng)物上進行原位基因電轉(zhuǎn)移，不僅操作簡便，且轉(zhuǎn)移效率較[1]。動物細(xì)胞電轉(zhuǎn)移不僅廣泛應(yīng)用于各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，而且為遺傳病的基因**了良好的前景。
（2）電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在植物細(xì)胞上的應(yīng)用
它可以效地把外源DNA或RNA攝取到受體細(xì)胞，建立起轉(zhuǎn)化新株。例如將質(zhì)粒pCMC1020導(dǎo)入大豆原生質(zhì)中，已選擇出轉(zhuǎn)化愈傷組織，并生長出根[2]。
又將pD23和pMP1質(zhì)粒導(dǎo)入玉米原生質(zhì)中經(jīng)選擇培養(yǎng)已獲得轉(zhuǎn)化植株[3][4]。植物電穿孔可以獲得耐寒、耐旱、抗蟲、抗病毒等良品種。
（3）電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在**上的應(yīng)用[5]
**電穿孔基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用研究近幾年來有了很大的發(fā)展，目前已有100多種**能成功地進行基因電轉(zhuǎn)移。
天津醫(yī)科大學(xué)第附屬醫(yī)院將質(zhì)粒D N A和噬菌體DNA成功地轉(zhuǎn)化或?qū)氪竽c桿菌。該電場單次電壓脈沖范圍1.0 k V/2.5 k V（初電場強度2.8kV/cm～16kV/cm）、電容范圍為5～20μF，用質(zhì)粒p U C 1 8和受體菌株D H 5α，獲得轉(zhuǎn)化率為109～1010/μgDNA。
（4）電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在酵母上的應(yīng)用
酵母細(xì)胞電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，如能把有關(guān)的目的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞而得到表達，并能篩選出所需要的菌株，則對制藥業(yè)、釀造業(yè)和輕工業(yè)起到巨大推動作用。
復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)系成功地進行了青島海葵強心多肽在枯草桿菌和畢氏膠木中的分泌表達研究。
3.2電穿孔技術(shù)的特殊應(yīng)用
（1）電插入法將蛋白分子
插入細(xì)胞膜當(dāng)外加電場大于或等于臨界值時，在細(xì)胞膜上形成親水的孔洞，貫通于細(xì)胞內(nèi)外。而當(dāng)外加電場稍小于臨界值，但可將外源蛋白質(zhì)插入細(xì)胞質(zhì)膜，而不造成明顯的損傷。這種新穎的方法叫電插入法。例如將CD4受體插入紅細(xì)胞膜上，不僅可以延長受體的循環(huán)生活期，而且了種**艾滋病的方法[6]。
（2）將蛋白分子導(dǎo)入細(xì)胞
在條件下，電穿孔可使細(xì)胞損傷小，而又使細(xì)胞有效地通透，將內(nèi)切酶抗體等導(dǎo)入細(xì)胞。例如將腫瘤天門冬酰胺合成酶的單克隆抗體導(dǎo)入SHU**細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞HT-5K，細(xì)胞成活率達80%～90%，而且90%的活細(xì)胞結(jié)合了抗體[7][8]。
（3）建立基因庫
電穿孔技術(shù)現(xiàn)已公認(rèn)是在原核細(xì)胞中進行基因轉(zhuǎn)移的有效的手段。對些好的菌株，其轉(zhuǎn)化率達1010/μgDNA，從而僅用少量DNA即可構(gòu)建綜合的基因庫。Dower等利用電穿孔方法已經(jīng)開發(fā)構(gòu)建大于109個獨立重組的質(zhì)粒庫[9]。
（4）在原位研究酶的活性
例如海膽卵在受精過程中，其生理活性增強，而酶是影響新陳代謝的因素，研究酶調(diào)節(jié)機制是令人感興趣的問題，電穿孔對細(xì)胞完整的干擾小，可以把帶標(biāo)記的底物導(dǎo)入細(xì)胞，進行酶活性的研究[10]。
（5）基因靶定向
在通常情況下，導(dǎo)入哺乳動物的DNA在細(xì)胞內(nèi)基因組由非同源重組整合到非特定位置上。導(dǎo)入的DNA也可以偶然地由同源重組直接整合到特定位置。這種同源重組稱為基因靶定向?；蜣D(zhuǎn)移效率越，同源重組體就越多。而電穿孔方法了個快速、效的將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法，使之能很容易的產(chǎn)生大量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，成為基因靶定向中誘導(dǎo)DNA進入細(xì)胞的個值得推薦的方法。
參考文獻
[1]Raptis,L.,andFirth,K.L.,1990DNACellbiol.9:615-621
[2]Christon,P.,et al.,1987,PNAS USA.84:3962-3966
[3]Rhodes.C.A.,etal.,1988Science240:204-207
[4]Allen,S.P.andBlaschek,H.P.,1990,FEMSMicrobriol.Lett.70:217-220
[5]宋詩鐸、張同海、祁偉、趙為誠、徐寶強、劉建民應(yīng)用電激法在大腸桿菌中導(dǎo)入外源性DNA生物工程學(xué)報1993，9（3）：237-240
[6]Zeira,M.,etal.,1991,proc.Natl.Acad.Sci,USA.88:4409-4413
[7]Chakrabarti,R.,1989,J.Biol.Chem.264:15494-15500
[8]BerglandD.L.,andStarkey,J.R.,1991,Cylometry12:64-67
[9]Dower,W.J.,and Cwirla,S.E.,1992,in“Guide to Electroporation and Electrofrsion ”Chang, D.C.,etal.,editors Academic press,Ssn Dieago p291-301
[10]Swezeg,R.R.,and Epel,D.,1992,同上，p347-361
孫云1,2，蘇明皓2，袁其平1，童崢嶸2，徐寶強2
（1.中民航學(xué)院,天津300300；2.天津理工大學(xué)光電信息與電子工程系,天津300191）
摘要 本文先介紹了細(xì)胞電穿孔的基本原理和天津理工大學(xué)自行研制的 基因脈沖導(dǎo)入儀，重點介紹了細(xì)胞電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、**、酵母上的應(yīng)用及電穿孔技術(shù)的些特殊應(yīng)用?；蛎}沖導(dǎo)入技術(shù)應(yīng)用前景十分廣泛。
關(guān)鍵詞基因脈沖導(dǎo)入，細(xì)胞電穿孔，膜電位
1細(xì)胞電穿孔的基本原理
細(xì)胞電穿孔是種新型生物物理新技術(shù)，它可使細(xì)胞可逆穿孔，從而導(dǎo)入外源RNA、DNA蛋白分子和各種小分子，產(chǎn)生具有新的生物性狀的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。該技術(shù)具有效率、低毒性、普適性和可控性的特點，在細(xì)胞工程和基因工程等方面具有廣泛應(yīng)用。
設(shè)細(xì)胞為球形，懸浮在溶液里并處于電場中。電場誘導(dǎo)的膜電位可由下式表示：
V=1.5αEcosθ
（1）式中α是細(xì)胞的半徑，E是外加電場強度，θ是經(jīng)過細(xì)胞膜任意點的徑向與電場方向之間的夾角。對于細(xì)胞的兩個點θ=0°或θ=180°，外加電場誘導(dǎo)的膜電位可進步簡化為：Vdp=1.5αE （2）
隨著外加電場強度的增大，在細(xì)胞膜上誘導(dǎo)的膜電位也隨之增大。當(dāng)增大到定程度，細(xì)胞膜將出現(xiàn)電穿孔現(xiàn)象。此時的誘導(dǎo)膜電位Vcr叫臨界膜電位，Ecr叫做臨界外加電場。般認(rèn)為，外加場強為1～10KV/cm、電脈沖的持續(xù)時間在1μs～10ms時細(xì)胞膜會出現(xiàn)微孔。
公式（1）是細(xì)胞電穿孔的理論基礎(chǔ)，又是實際應(yīng)用的依據(jù)。但是實際情況是非常復(fù)雜的。例如，所有細(xì)胞都不是理想的球形，不同細(xì)胞形態(tài)各異、大小不同，就是同種細(xì)胞的大小、形狀也有區(qū)別；不同細(xì)胞膜組分有所不同，不同的培養(yǎng)條件以及細(xì)胞懸浮液成分不同造成生理條件不同等，對電穿孔都有不同程度的影響。因此公式不能給出準(zhǔn)確值，只能給出參考值，應(yīng)用中的實際電場強度仍需由實驗來確定。
2導(dǎo)入技術(shù)
2.1導(dǎo)入技術(shù)的介紹
基因脈沖導(dǎo)入儀的主要功能是產(chǎn)生個電壓、大電流指數(shù)規(guī)律的尖脈沖。其主要組成包括壓脈沖產(chǎn)生器、微機控制板和電小池。
無論在阻或低阻（例如含鹽或蔗糖緩沖液）情況下都可以正常工作，可用于植物、動物和各種微生物的各類細(xì)胞電穿孔，并能得到很的轉(zhuǎn)化率。該儀器用電擊法和傳統(tǒng)法相比簡單易行，省時間，效率，達到外同類產(chǎn)品的致效果。
根據(jù)客戶要求在原有產(chǎn)品基礎(chǔ)上我們又做了改進，研制出LN-201、301系列產(chǎn)品。LN-301系統(tǒng)框圖如圖2所示。該儀器采用點陣式LCD顯示，能夠同時顯示多個信息，可做到漢字、字符同屏，便于用戶的操作和使用。系統(tǒng)可單脈沖和多脈沖兩種功能，便于用戶的選擇使用。組合電容由0.5、1、2、4、8、10μF的6個電容組合而成，可根據(jù)用戶的需要自由地組合。為了避免壓放電對單片機的干擾，采用了數(shù)字地和模擬地各自獨立的方式，使該儀器的穩(wěn)定性、可靠性得到較大的提。
與此配套的放電小池有1mm、2mm、4mm三種不同規(guī)格的放電小池。其中2mm、4mm小池的電有粘貼型的，1mm、2mm小池電有采用工字鋁注塑型的。
2.2電改進
在原有各種電解小池的基礎(chǔ)上，為了更好的滿足客戶在基因**和臨床醫(yī)學(xué)方面的要求，我們又提出針狀電代替放電小池的方案，研制出各種放電電如用于動物原地**注入（**增敏）和轉(zhuǎn)基因的針狀電（平行和梅花形）。四川大學(xué)實驗表明，當(dāng)定強度的瞬態(tài)電磁脈沖作用于細(xì)胞體時，在細(xì)胞膜上將形成瞬時微孔，促進**等大分子進入細(xì)胞液。利用電穿孔結(jié)合******在昆明小鼠上接種和生長的S-180肉瘤，結(jié)果證明，這種方法可以明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的生長。中醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形醫(yī)院，用針狀和平板的組合電，實驗進展很順利，取得了很好的效果。
3技術(shù)應(yīng)用
3.1電穿孔誘導(dǎo)基因的應(yīng)用
（1）電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在動物細(xì)胞上的應(yīng)用利用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)化動物細(xì)胞雜種已成為許多實驗室種有效的常規(guī)手段。電穿孔轉(zhuǎn)化率比傳統(tǒng)方法要數(shù)倍至上千倍。對貼壁生長的細(xì)胞，可以在單層培養(yǎng)物上進行原位基因電轉(zhuǎn)移，不僅操作簡便，且轉(zhuǎn)移效率較[1]。動物細(xì)胞電轉(zhuǎn)移不僅廣泛應(yīng)用于各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，而且為遺傳病的基因**了良好的前景。
（2）電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在植物細(xì)胞上的應(yīng)用
它可以效地把外源DNA或RNA攝取到受體細(xì)胞，建立起轉(zhuǎn)化新株。例如將質(zhì)粒pCMC1020導(dǎo)入大豆原生質(zhì)中，已選擇出轉(zhuǎn)化愈傷組織，并生長出根[2]。
又將pD23和pMP1質(zhì)粒導(dǎo)入玉米原生質(zhì)中經(jīng)選擇培養(yǎng)已獲得轉(zhuǎn)化植株[3][4]。植物電穿孔可以獲得耐寒、耐旱、抗蟲、抗病毒等良品種。
（3）電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在**上的應(yīng)用[5]
**電穿孔基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用研究近幾年來有了很大的發(fā)展，目前已有100多種**能成功地進行基因電轉(zhuǎn)移。
天津醫(yī)科大學(xué)第附屬醫(yī)院將質(zhì)粒D N A和噬菌體DNA成功地轉(zhuǎn)化或?qū)氪竽c桿菌。該電場單次電壓脈沖范圍1.0 k V/2.5 k V（初電場強度2.8kV/cm～16kV/cm）、電容范圍為5～20μF，用質(zhì)粒p U C 1 8和受體菌株D H 5α，獲得轉(zhuǎn)化率為109～1010/μgDNA。
（4）電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移在酵母上的應(yīng)用
酵母細(xì)胞電穿孔誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，如能把有關(guān)的目的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞而得到表達，并能篩選出所需要的菌株，則對制藥業(yè)、釀造業(yè)和輕工業(yè)起到巨大推動作用。
復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)系成功地進行了青島海葵強心多肽在枯草桿菌和畢氏膠木中的分泌表達研究。
3.2電穿孔技術(shù)的特殊應(yīng)用
（1）電插入法將蛋白分子
插入細(xì)胞膜當(dāng)外加電場大于或等于臨界值時，在細(xì)胞膜上形成親水的孔洞，貫通于細(xì)胞內(nèi)外。而當(dāng)外加電場稍小于臨界值，但可將外源蛋白質(zhì)插入細(xì)胞質(zhì)膜，而不造成明顯的損傷。這種新穎的方法叫電插入法。例如將CD4受體插入紅細(xì)胞膜上，不僅可以延長受體的循環(huán)生活期，而且了種**艾滋病的方法[6]。
（2）將蛋白分子導(dǎo)入細(xì)胞
在條件下，電穿孔可使細(xì)胞損傷小，而又使細(xì)胞有效地通透，將內(nèi)切酶抗體等導(dǎo)入細(xì)胞。例如將腫瘤天門冬酰胺合成酶的單克隆抗體導(dǎo)入SHU**細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞HT-5K，細(xì)胞成活率達80%～90%，而且90%的活細(xì)胞結(jié)合了抗體[7][8]。
（3）建立基因庫
電穿孔技術(shù)現(xiàn)已公認(rèn)是在原核細(xì)胞中進行基因轉(zhuǎn)移的有效的手段。對些好的菌株，其轉(zhuǎn)化率達1010/μgDNA，從而僅用少量DNA即可構(gòu)建綜合的基因庫。Dower等利用電穿孔方法已經(jīng)開發(fā)構(gòu)建大于109個獨立重組的質(zhì)粒庫[9]。
（4）在原位研究酶的活性
例如海膽卵在受精過程中，其生理活性增強，而酶是影響新陳代謝的因素，研究酶調(diào)節(jié)機制是令人感興趣的問題，電穿孔對細(xì)胞完整的干擾小，可以把帶標(biāo)記的底物導(dǎo)入細(xì)胞，進行酶活性的研究[10]。
（5）基因靶定向
在通常情況下，導(dǎo)入哺乳動物的DNA在細(xì)胞內(nèi)基因組由非同源重組整合到非特定位置上。導(dǎo)入的DNA也可以偶然地由同源重組直接整合到特定位置。這種同源重組稱為基因靶定向?；蜣D(zhuǎn)移效率越，同源重組體就越多。而電穿孔方法了個快速、效的將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法，使之能很容易的產(chǎn)生大量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化體，成為基因靶定向中誘導(dǎo)DNA進入細(xì)胞的個值得推薦的方法。
參考文獻
[1]Raptis,L.,andFirth,K.L.,1990DNACellbiol.9:615-621
[2]Christon,P.,et al.,1987,PNAS USA.84:3962-3966
[3]Rhodes.C.A.,etal.,1988Science240:204-207
[4]Allen,S.P.andBlaschek,H.P.,1990,FEMSMicrobriol.Lett.70:217-220
[5]宋詩鐸、張同海、祁偉、趙為誠、徐寶強、劉建民應(yīng)用電激法在大腸桿菌中導(dǎo)入外源性DNA生物工程學(xué)報1993，9（3）：237-240
[6]Zeira,M.,etal.,1991,proc.Natl.Acad.Sci,USA.88:4409-4413
[7]Chakrabarti,R.,1989,J.Biol.Chem.264:15494-15500
[8]BerglandD.L.,andStarkey,J.R.,1991,Cylometry12:64-67
[9]Dower,W.J.,and Cwirla,S.E.,1992,in“Guide to Electroporation and Electrofrsion ”Chang, D.C.,etal.,editors Academic press,Ssn Dieago p291-301
[10]Swezeg,R.R.,and Epel,D.,1992,同上，p347-361